Clonage in-vitro, possible?

[djaman 0]

Salut la communauté,

 

djaman est de retour donc z'ai une tite question.

En fait chui en fin de flo et des boutures deja reoltée et seches et des phénos de ouf. Gout blueberry a fond, très sucré, une défonce de ouf, bref le nirvana de chez dutch passion.

 

donc la question, est-ce que c'est possible de prélever quelques cellules, (lesquelles), sur un pied en flo et de les faire se reproduire in vitro style "culture de peau humaine", et ainsi recréer une plante par un procédé?

 

merci s'il y a des experts

 

a+

[Sir_Galahad 28]

Hello,

 

bien sur que c'est possible mais cela demande du matériel. On appelle cela la micropropagation...

 

Les phases de la micropropagation

 

Voici globalement les cinq stades de la micropropagation:

 

0. Conditionnement des plants mères;

1. Établissement (ou initiation ) d’une culture aseptique;

2. Multiplication des tiges;

3. Rhizogénèse (ou enracinement des tiges);

4. Acclimatation des plantules.

 

Stade 0 : Conditionnement des plants mères

 

Dans la description de cette technique on passe souvent sous silence le stade 0 qui contribue pourtant pour beaucoup au succès des stades suivants. Ce stade 0 réfère au conditionnement du plant mère. En effet, le plant mère devrait être dépourvu de carences minérales et en pleine turgescence donc sans stress hydrique important. Au mieux et dans

presque tous les cas, le plant devrait être en croissance active, donc mis en culture en dehors de sa période de dormance. Ceci limite dans le calendrier de production, les dates préférables de mises en culture pour le stade d’initiation. Mais, une fois in vitro, ces plants pourront être multipliés à l’année longue. Aussi les plants mères choisis le seront en fonction

de leur état sanitaire. Des plants infestés d’insectes peuvent apporter des problèmes de taille à toute une chambre de culture. A titre d’exemple, les œufs de thrips qui se logent dans les interstices des bourgeons résisteront à la stérilisation de surface des apex. Par la suite, des conditions favorables permettront leur éclosion. Les larves et les adultes particulièrement se déplaceront d’un tube à l’autre en quête de nourriture. Ces insectes sont suffisamment petits pour se glisser sous les bouchons et pénétrer dans les tubes. On peut soupçonner leur visite lorsque des moisissures envahissent les contenants longtemps après la mise en culture.

 

Stade 1 : Établissement d’une culture aseptique: Durée 6 à 8 semaines

 

La littérature fournie souvent les premières informations essentielles au départ d’une culture. On trouve dans les livres ou revues spécialisés le détail des formulations (recettes) de milieux nutritifs convenant àde très nombreuses espèces végétales. Généralement les auteurs précisent aussi le protocole de désinfection de surface des explants ainsi qu’une description de l’explant mis en culture. Ce stade est de première importance puisqu’il comporte de nombreux facteurs critiques :

 

• Le choix du plant mère;

• Le choix du fragment végétal à mettre en culture;

• Une stérilisation de surface adéquate garantissant la survie de l’explant tout en assurant l’asepsie;

• La découpe de l’explant et sa position sur la gélose;

• Le choix du milieu de culture qu’il est parfois nécessaire d’ajuster légèrement par la suite suivant la réponse de l’explant;

• La qualité du travail en asepsie de la technicienne ou du technicien.

Dans plus de 50 % des cas, les premiers essais de mise en culture sont très satisfaisants et demandent très peu ou pas d’ajustements. Pour certains autres cas, la difficulté réside dans la désinfection des végétaux, pour d’autres dans l’ajustement de l’équilibre hormonal. Mais selon tous les auteurs, théoriquement tous les végétaux quels que soient leur espèce

ou leur cultivar, peuvent être cultivés in vitro.

Les explants les plus aptes à entreprendre une multiplication sont généralement riches en bourgeons ou en zones méristématiques potentielles. Ils varient selon les espèces:

 

• Les feuilles (ex. Ficus, Saintpaulia, Bégonia…);

• Les tiges (asperge, colza…);

• Les bourgeons (fraisier, vigne, lilas, bleuet…);

• Inflorescences (chou-fleur, gerbera, hosta, poireau …).

 

La multiplication à partir de la croissance de bourgeons axillaires offre les meilleures chances de conserver les caractéristiques de l’espèce ou de la variété. En effet, cette technique ne fait qu’accélérer le fonctionnement normal des méristèmes de bourgeons déjà présents sur la plante. Par contre, on diminue les chances d’une stabilité génétique en provoquant l’apparition de bourgeons nouveaux (la plupart du temps à partir d’un cal, en des endroits inhabituels tels les feuilles, les tiges, les racines).

 

 

Stade 2 : La multiplication des tiges: Durée 4 à 5 semaines.

 

Cette étape s’effectue au repiquage des plantules obtenues au stade précédent. On veut

ici accroître le nombre de plants d’un facteur de 4 à5 à chaque cycle chez les ligneux, et

d’un facteur de 4 à 12 chez les herbacées.

Le milieu nutritif utilisé est souvent identique à celui du premier, bien qu’une différence

parfois mineure s’observe dans la balance hormonale (équilibre auxine-cytokinine). Au

stade de la multiplication, les cytokinines sont généralement présentes en plus grande

concentration dans le milieu que les auxines. Ceci s’explique d’un point de vue

physiologique par le fait que les cytokinines s’opposent à la dominance apicale donc

stimulent la croissance de nouvelles tiges. Encore une fois, la littérature fournie

généralement les informations nécessaires nous permettant de fixer notre choix sur une

formulation appropriée.

La vitesse de croissance des plantes in vitro se module àcelle in situ. Si l’espèce mise en

culture est àcroissance lente, on peut s’attendre à observer une croissance lente dans les

tubes.

 

Stade 3 : La rhizogénèse (enracinement ) : Durée 2 à 4 semaines

 

Cette étape se caractérise par la naissance de racines sur les tiges feuillées obtenues au

stade de la multiplication. Il arrive parfois que des espèces présentent un système racinaire

plus ou moins développé au stade de la multiplication. Dans ce cas, il serait avantageux de

faire des essais pour le passage immédiat en acclimatation. On économise ainsi temps et

argent s’il nous est possible de passer outre cette étape (ex. Bégonia, Saintpaulia,

fougère). Toutefois, si ce stade s’avère nécessaire, le milieu de culture varie quelque peu

des milieux précédents. Les sels minéraux et les vitamines demeurent généralement les

mêmes. Mais dans le cas du rosier par exemple, on suggère de diminuer la concentration

des sels minéraux de moitié.

La différence majeure se situe principalement au niveau de l’équilibre hormonal qui se fera

cette fois en faveur des auxines. Des tiges très feuillées et bien pourvues de bourgeons

s’enracineront assez facilement dans un milieu dépourvu de régulateurs de croissance. Les

jeunes feuilles et les bourgeons sont des sites naturels de production d’auxine et à l’image

des boutures traditionnelles, ces jeunes plantules sauront s’enraciner d’elles-mêmes. Par

contre, certaines espèces exigent l’apport d’auxines afin de stimuler l’initiation de leurs

racines. Cet auxine est souvent fourni sous forme d’AIA.

 

Stade 4 : L’acclimatation: Durée 3 à 4 semaines

 

Il s’agit de la dernière étape qui consiste à adapter progressivement les microplantules aux

conditions qui prévalent dans la serre ou à l’extérieur. Après avoir éliminé la gélose de la

base des plants, ils sont transférés dans un substrat horticole. Les parties aériennes sont

ensuite recouvertes de manière à les maintenir dans un environnement qui avoisine les 100

% d’humidité relative. Les stomates de ces jeunes feuilles cultivées in vitro demeurent

constamment ouverts et laissent donc s’échapper l’eau de transpiration de manière

continue. Les risques de dessèchement sont très élevés. Aussi doit-on attendre la

croissance de nouvelles feuilles fonctionnelles avant d’enlever progressivement la pellicule

de recouvrement.

 

Source : Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999

 

Comme tu peux le voir ce n'est pas à la portée de tout le monde...

 

Merci à Salutatis pour ce document posté dans le forum pro

 

++

[arboriginal 1]

Salut,

 

en gros tu veux faire du clonage... donc boutures...

 

Sinon il te faut un labo et des conditions irréprochables, des connaissances en biologie que tu ne sembles pas avoir (sinon tu ne poserais pas la question)... et encore je ne suis pas sûr.

 

Bref, te prends pas la tête à jouer au savant fou et fais toi simplement des boutures...

 

A+

 

Edit : Grillé par Sir à cause des messages "Site en maintenance"...

Je n'avais pas l'info complète mais je vais lire ce qu'il t'a posté (pour info seulement)

[Invité leblond]

Bonjour !

 

Je voulais juste ajouter une truc, étant en étude de bio-agronomie je me permet d'ajouter ceci:

 

En dehors de conditios stériles la culture IN VITRO est impossible car il suffit d'un contact avec de l'air normal (celui qu'on respire) et hop, des dizaines de spores de champi sont dans ton milieu de culture et c'est foutu...

 

Et en plus, pour permettre les différentes étapes de propagation: multilication, rhizogénèse, dévellopement de l'appareil aérien; il te faudrait des hormanes à des compositions spéciales et très précises que tu ne trouve pas en dehors des fourniseurs des labo de bio donc assez chiant à trouver...

Et en plus les dosages dépendent de la plante à cloner.

 

Je pense que le bouturage/plante mère est l'alternative la moins couteuse et la moins complexe à mettre en oeuvre si tu veux conserver un bon phéno...

 

A pluche !

[djaman 0]

Salut,

 

merci beaucoup, j'ai tout lu et j'ai fait ça au bahu a l'époque. Je vais refaire une réponse quand j'aurai 'traduit' les mots techniques ainsi que certains passages qui peuvent paraître compliqués à comprendre.

 

a++

 

edit: ben je sais bouturer mais le truc c'est que je suis en pleine flo et déja que c'est pas top niveau stabilité chez la blueberry féminisée, je voulais voir un peu.

 

Et je ne veux pas jouer au savant fou mais ou est le problême de s'informer?? huuh?

 

tchoo

[titoon29 309]

Salut

 

C'est long ( 2 mois pour que ça prenne), ca nécessite des conditions drastiques d'hygiène/stérilité, mais c'est faisable, avec un gros avantage, on peut faire de la micropropagation quasi a partir de n'importe quel tissu, donc une tete seche ferait l'affaire... pratique hein !

 

Si tu as la motivation, y a un article payant là

 

Et un gratuit en anglais là

 

En en bonus pour la motivation, image provenant de feu Overgrow

 

 

Sinon je sais que pas grand monde ne le pratique, mais il existe quelques warriors, et ça marche...

Pour ça faut google "cannabis tissue culture"...

Il existe des kits de propagation maison pour environ 200E (quand meme !)

 

Titoon

[djaman 0]

Titoon t'es une bête, merci pour les articles, la photo qui donne envie d'attaquer la chose .

 

Mais est-ce que tu connais un bon site où je peux commander un tel kit?

edit: j'ai trouvé un SITE qui explique les précautions à prendre lors des manips.

 

cho

[Invité leblond]

Salut !

 

Merci Beaucoup titoon poue cette magnifique publi !!!

Je pense que grâce à ça je pourrais tenter cette micropropagation, me reste à voir avec des peronnes compétentes pour récupérer le matos ^^...

 

A bientôt !

[djaman 0]

Salut people,

je viens juste de me commander un kit sur un site pour 110$ frais de port inclus qui me permet de faire 15 essais. Tout est fourni, meme les produits périssable.

 

S'il y a des interessé, voila le lien de mon achat.

 

a+

[Sir_Galahad 28]

Reuh,

 

mais c'est faisable' date=' avec un gros avantage, on peut faire de la micropropagation quasi a partir de n'importe quel tissu, donc une tete seche ferait l'affaire... pratique hein !

[/quote']

 

euh dis moi, tu serais pas en train de dire une grosse bêtise là ? Il faut quand même des tissus vivants O_o

 

++

[negura 39]

Salut,

 

ben je sais bouturer mais le truc c'est que je suis en pleine flo

 

Sa ne serai pas plus simple pour toi de faire une regénération ?

 

A+

 

Edit : Sa te permet de "sauver" le phéno si ton experience ne fonctionne pas.

[djaman 0]

Ouais mais une regénération ça crée pas mal de stress.. et deja que c'est des pieds féminisés.. donc voilà et j'ai envie de voir aussi ce que ça donne.

[ElGringo69 2]

Salut,

 

Sympa ce sujet, vous assurez sur l'info ^^

 

djaman, j'espère que tu nous tiendra au jus. J'suis pas certains que la technique me sera utilise, mais bon j'suis curieux :-D

 

Schuss.

[djaman 0]

Yes les gars, je ferai un topic.

La j'attend le matos.. de ce qui est des conditions optimales, pour la temperature g mon idéé. Comme l'espace n'a pas besoin d'être geand au début, je vais prendre une tube, le remplir de flotte et mettre un chauffe-eau d'aquarium, fermer le tout et faites chauffez. (faut quand meme laisse un trou pour la pression et remplir avec de l'eau de temps a autre..

(ne jamais faire fonctionner un chauffe eau en dehors de l'eau, ça peut péter)

 

a+

[Invité leblond]

Salut les cloneurs !

 

Djaman je suis allé sur ton site et je ne trouve pas le contenu du kit ?! c'est pas bizarre ?

 

Et sinon les hormones d'un kit ne seront pas forcément valables sur le canna, les balances hormonales de chaque espèces sont assez précises et c'est ça qui rend l'in itro su difficile (en plus des conditions de stérilité).

 

Sur le PDF de titoon, ils indiquent que dnas beaucoup de cas le seul truc que les cals font de sont des racines, et que très peu d'études ont permis de réliser des plantules in vitro de canna...

 

Donc je sais pas trop ce que ça va donner...

 

Bonne chanc en tout cas !

[djaman 0]

Salut peuple,

 

ben je sais pas non plus ce que ça va donner, mais qui ne tente rien n'a rien, bon fo pas tenter tout et n'importe quoi non plus. Mais cependant, est-ce que qqn a une base de donnée sur les hormones nécessaire au canna pour ce clonage?

 

a+

[Invité leblond]

Re:

 

qqn a une base de donnée sur les hormones nécessaire au canna pour ce clonage ?

 

L'article PDF de titoon !

 

En gros, pour la phase de prolifération des cellules du procambium (cellules qui formeront le cal avec certaines cellules du cambium) afin de former le Cal, les meilleurs résultats sont obtenues avec un milieu de base MS (Murashige et Skoog, du nom des types qui l'ont inventé... c'est un milieu nutritif de base pour beaucoup de culture in vitro) enrichi avec une solution de 2 à 3mg/L de Dicamba (herbicide à forte dose, mais acteur de la prolifération cellulaire à faible concentration).

 

Ensuite, un fois le cal bien formé (3 semaines), il faut le diviser en petits cubes de 0,5cm^3 et replacer les petits cubes obtenus dans les nouveaux milieux:

 

MS + 2 (si 3mg/L au d&but) ou 3 (si 2mg/L au début) mg/L de Dicamba ou un mélange de 1mg/L de KIN et 0,5mg/L de NAA.

 

Le KIN (kinétine), le NAA (acide 1-acétylnaphtalénique) et l'AIA (auxine) sont trois phytohormones.

L'auxine et le NAA font parit le la même famille et ont un rôle dans le rythme de division cellulaire ainsi que dans leur différenciation (forte concentraion -> tige/feuilles; faible -> racines pour simplifier) alors que la kinétine joue spécifiquement sur la croissance cellulaire.

 

enfin, au bout d'à peu près 4-5 semaines, les premières ébauches de feuilles aparaissent avec une mini tige...

Il faut alors les transplanter dans un milieu MS contenant en plus 1mg/L d'auxine (AIA ou IAA en anglais) et 1mg/L de NAA...

 

Voilà, mais si tu arrive à faire un cal avec une régénération de plantule, la fabrication des racines peut être faite en ajouter qqes goutes de clonex... c'est l'étape la plus simple....

 

Le plus dur est de faire repartir une tige et des feuilles à partir du Cal !

 

Tout le dévellopement du végétal est affaire de balance hormonale donc... faut pas se gourrer ^^ !

[finety 0]

ou trouve t'on di dicamba ?

peut on le remplacer des le debut par du kin et du naa ?